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科技支撑计划可行性研究报告提纲
(对外科技合作项目参照此提纲)
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1,项目所处技术领域产业政策,
2,项目所处技术领域国内外现状和技术发展趋势,
3,项目技术先进性,对相关领域技术进步推动作用,
4,项目目前进展情况及市场分析.
中国目前有4000万糖尿病患者,2型糖尿病病程超过15年,将有75患者因视力下降而丧失工作能力.目前研究提出多种可能导致糖尿病各种血管并发症假说,然而没有单一理论能解释所有这些血管病变.新研究表明甘油二酯(DAG)蛋白激酶C(PKC)信号通路异常激活可能攘括大病理改变1,PKC,内皮素(ET)系统对糖尿病血管并发症发生发展所起作用日趋关注焦点.
高糖条件下,葡萄糖转运体向细胞内转运增加,多种糖化产物和氧化产物均改变信号转导通路,使得DAG水平升高,激活PKC.静止细胞中PKC主要于细胞浆中,细胞内DAG合成释放导致PKC激活,并从细胞浆中移位到细胞膜上,此过程称之为转位,是PKC激活标志.PKC激活可能继发一些因子,如内皮素1(ET1),血管内皮细胞生长因子(VEGF)和细胞间黏附分子(ICAM1)2,3,4等改变,其中血管ET系统功能异常可能是PKC活化导致视网膜血流动力学和内皮细胞功能改变机制之一5.ET强大缩血管作用,在眼内分布广泛,在视网膜内主要表达ET1,ET3,ETA,ETB受体,ET系统在调节和维持视网膜血流稳定性中起到关键作用6.有研究表明糖尿病患者在尚未出现临床血管并发症之前,已经出现血浆ET1水平升高,而且血浆ET1水平与病程,病变严重程度成正相关7,8.
然而,高血糖对信号转导通路效应尚处于初步研究阶段,有关PKC,ET系统对微血管病变关系尚缺乏足够试验证据,其所起作用承待进一步说明.
本课题首次探讨PKC,ET系统与糖尿病视网膜微血管病变相关性,首次分析高糖对视网膜中PKC活性影响,检测视网膜中何种异构体起主要作用,首次从因子水平观察ET对视网膜血流影响,并首次尝试用蛋白激酶拮抗剂等进行干预研究,观察是否可有效地阻断此信号转导通路,可以进一步揭示糖尿病视网膜病变发病机制,防止多种糖尿病视网膜微血管病变发生,为糖尿病视网膜病变预防和治疗,挽救广大糖尿病患者视力开辟一条新途径,本研究重要理论价值和应用价值.
1,项目技术关键点或创新点论述,项目完成时技术水平,
2,项目技术方案论述生产技术,工艺流程,主要技术参数,
3,项目技术质量指标项目产品主要技术性能指标,执行质量标准,通过国家相关行业许可认证等,
4,分阶段描述项目执行过程中各阶段目标,
5,项目经费预算情况项目投资总额,项目已完成投资,项目须新增投资及投资构成和投资预算,申请科技三项经费使用预算(见附表).
研究方法1.糖尿病大鼠建立与分组
选择200250g雄性SD大鼠36只,随机分为10只正常组大鼠和26只糖尿病组大鼠.糖尿病模型建立腹腔内一次性注入Streptozotocin55mgKg,2448hr测尾静脉血糖,≥16.7mmoll确认模型建立,给予自由进食进水,维持2周.以速眠新1mlKg体重肌肉麻醉后,分离视网膜组织或进行玻璃体内注射.
2.糖尿病大鼠视网膜PKC活性和同功酶表达检测
取正常组及糖尿病组大鼠各6只,2个视网膜一个标本.
1)新鲜视网膜于缓冲盐溶液(100μmollγ32PATP含1,0001,400cpmpmol,和100μmollofPKC特异性底物)中30°C孵育10min,25三氯醋酸(TCA)中止反应,离心,取上清置于磷酸纤维素滤纸上,液态闪烁仪计数.
2)PKC同功酶表达取新鲜大鼠视网膜,制备膜蛋白和浆蛋白,8SDSPAGE分离纯化PKC组分,转膜,与各种多克隆抗体(抗PKCβ1,β2,α,δ,ε)反应,通过化学发光Westernbl5.1otting检测,图像密度测定仪分析.
3)大鼠视网膜血流改变HRT检测.
3.测定内皮素系统
取正常组及糖尿病组大鼠各4只,每个视网膜一个标本,视网膜内ET1,ET3,ETA,ETB受体mRNA测定采用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR).用Trizol试剂(美国LifeTechnologies公司)抽提视网膜内总RNA.由Oligo(dT)15作引物,根据cDNA合成试剂盒使用手册进行逆转录反应,每个逆转录产物均分别进行ET1,ET3,ETA,EAB受体扩增,βactin参照.进行引物设计及PCR扩增,分别取PCR产物8ul,βactin6ul在含0.5ugml溴化乙锭1.5琼脂糖中电泳,采用GeneGenius凝胶成像系统观测电泳结果,以ET1,ET3,ETA,EAB受体与βactinPCR产物DNA条带灰度值之比反映mRNA水平相对指标,作半定量分析.
4.特异性PKCβ抑制剂干预
取2周糖尿病大鼠随机分为对照组(4只大鼠)和干预组(每个剂量各4只大鼠).干预组分别给予105,106,107molL3个浓度梯度GF109203X10ul(美国Calbiochem公司,1二甲基亚砜溶剂)玻璃体内注射.维持30min,麻醉后处死后分离视网膜组织,RTPCR测定视网膜内ET1Mrna.
5.统计学
结果均以±s表示,数据采用SPSS10.0统计软件进行成组设计两样本均数比较t检验,干预实验采用单因素方差分析.
重点解决技术关键1.链脲佐菌素(STZ)诱导早期糖尿病大鼠模型
2.观察糖尿病状态下PKC和ET系统改变,探索视网膜中PKC异构体分布和活性,观察PKC异构体对ET1等因子分泌影响.
3.采用玻璃体内注射特异性PKC抑制剂(GF109203X)后观察对ET1影响.
本课题根据细胞内信号转导通路慢性激活在糖尿病并发症中可能起作用,首次探讨PKC,ET系统与糖尿病视网膜微血管病变相关性,首次分析高糖对视网膜中PKC活性影响,检测视网膜中何种异构体起主要作用,首次从因子水平观察ET对视网膜血流影响,并首次尝试用蛋白激酶拮抗剂等进行干预研究,为糖尿病视网膜病变预防和治疗开拓新途径,本研究重要理论价值和应用价值.
本课题立论依据,设计合理,巧妙,科学性强,有创新性,研究成果有望填补国内空白.
四,预期成果
1.糖尿病大鼠视网膜内细胞膜PKC活性较正常组明显升高,而细胞浆PKC活性则无明显改变.
2.糖尿病大鼠视网膜内ET1mRNA表达较正常组明显增加,而ET3,ETA,ETB受体mRNA表达较正常组则无明显改变.
3.给予糖尿病大鼠玻璃体内注射PKC抑制剂GF109203X,可使视网膜内ET
临床医学相关论文例文1mRNA表达下降,并呈剂量反应关系,其105molLGF109203X可使ET1恢复至正常水平.
五,提供结果形式在国内外期刊上发表相关论文.
六,各阶段目标
2016年1月2016年3月动物模型建立与分组,
2016年4月2016年8月糖尿病大鼠视网膜PKC活性检测和同功酶表达,
2016年9月2016年12月观察各种特异性PKC对细胞ET表达和分泌影响,
2016年1月2016年5月视网膜内ET系统测定,
2016年6月2016年9月特异性PKCβ抑制剂(GF109203X)干预后,观察视网膜血流和ET1等因子mRNA表达改变,
2016年10月2016年12月.
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